AFAF BAKTIR, 099712479 D (2004) KLONING FRAGMEN GEN DAN KARAKTERISASI ENZIM DEKSTRANASE B7DEX YANG BERPELUANG SEBAGAI PENGHAMBAT PEMBENTUKAN PLAK GIGI. Disertasi thesis, UNIVERSITAS AIRLANGGA.

Preview	Text (ABSTRAK) gdlhub-gdl-s3-2006-baktirafaf-3381-dism07-k.pdf Download (558kB) | Preview
Preview	Text (FULL TEXT) 32798.pdf Download (2MB) | Preview

Abstract

Enzim dekstranase telah dikembangkan sebagai bahan pencegah plak gigi, Bentuk sediaan campuran enzim dekstranase dan mutanase memberikan hasil yang jauh lebih efektif dibanding sediaan tunggalnya, akan tetapi masih terdapat permasalahan terkait pendeknya durasi kontak antara enzim dengan plak, metode delivery yang belum dapat mencapai seluruh lokasi plak, lambatnya difusi enzim ke dalam plak dan kebutuhan pemakaian secara sinambung. Di Indonesia telah dikembangkan produksi enzim B7DEX (dekstranase dari mikroba B7), yang telah diuji coba aplikasinya sebagai bahan untuk mengatasi problema dekstran dalam proses produksi gula di beberapa industri gula. Terdapat kesamaan antara matriks agregator sel dalam plak gigi dan dekstran dalam pabrik gula, yaitu keduanya merupakan glukan yang mengandung ikatan glikosida a-1,6, yang dapat dihidrolisis oleh enzim dekstranase. Oleh karena itu pada kesempatan ini diteliti apakah B7DEX mempunyai aktivitas terhadap plak gigi dan memiliki karakter yang menunjang aktivitas ini. Apabila B7DEX menunjukkan aktivitas dan karakter tersebut maka dilakukan kloning gen B7DEX, yang pada kesempatan lain akan dilakukan fusi dengan gen penyandi enzim mutanase, untuk di-koekspresikan pada salah satu flora normal rongga mulut sehingga diperoleh sistem sekresi sinambung enzim B7DEX dan mutanase, sehingga dapat mengatasi problema pendeknya durasi kontak, lambatnya difusi enzim ke dalam plak dan metode delivery enzim pada seluruh target. Gen-gen penyandi enzim dekstranase menunjukkan homologi yang sangat rendah atau hampir tidak ditemukan homologi di antara urutan-urutan dekstranase yang telah dilaporkan. Untuk melakukan kloning gen B7DEX pada kesempatan ini dicoba melalui pendekatan berikut. Mula-mula disiapkan informasi tentang mekanisme kerja dan nama mikroba penghasil enzim B7DEX sebagai data untuk menentukan XDEX, yang merupakan urutan acuan untuk menentukan anggota¬anggota famili B7DEX, sehingga dari sini dapat dirancang primer atas dasar homologi daerah lestari dalam anggota famili B7DEX. Namun sampai saat ini belum diketahui jenis mikroba B7, termasuk kelompok manakah dalam sistem taksonomi, serta belum pula diketahui mekanisme kerja i jenis B7DEX. Atas dasar latar belakang yang telah diuraikan dan untuk menjawab permasalahan penelitian maka dilakukan suatu penelitian yang bertujuan untuk mengkaji karakter-karakter B7DEX, terutama yang terkait potensinya sebagai bahan pencegah dan pelenyap plak gigi, serta melakukan kloning gen B7DEX Penelitian ini terdiri dari 5 sub-penelitian yang merupakan penelitian diskriptif eksploratif. Setelah isolat B7 diidentifikasi pada penelitian I melalui analisis 16S rRNA, selanjutnya dilakukan produksi, isolasi dan karakterisasi B7DEX (penelitian II). Kemudian dilakukan penentuan aktivitasnya terhadap glukan dari plak gigi (penelitian Ill). Apabila B7DEX menunjukkan kemampuan menghidrolisis glukan dari plak gigi serta memiliki karakter-karakter yang mendukung aktivitas hidrolisis tersebut, maka akan dilanjutkan dengan tahap penelitian terakhir (V), yaitu kloning gen B7DEX dengan metode amplifikasi gen target dengan PCR. Sebelum tahap penelitian terakhir ini diperlukan tahapan perancangan primer dengan menggunakan data pendukung mekanisme kerja B7DEX dan nama isolat B7 (penelitian IV). Dari dua buah data tersebut dapat diperoleh sebuah urutan DEX dari database NCBI, yaitu XDEX. Apabila dilakukan penjajaran XDEX dengan menggunakan program BLAST-X, diharapkan akan memunculkan sejumlah urutan DEX yang merupakan famili B7DEX. Penjajaran urutan-urutan DEX yang sefamili akan menghasilkan beberapa daerah lestari, yang selanjutnya dapat digunakan untuk merancang sepasang primer. Hasil penelitian I menunjukkan bahwa isolat B7 adalah Arthrobacter sp strain B7. Hasil penelitian II memperiihatkan karakter enzim B7DEX sebagai berikut: pH optimum7, suhu optimum 500 C, pH stabilitas 7 (pada 300 C 1 jam aktivitas dipertahankan 100% dengan adanya BSA, dan tersisa 98,7 % tanpa BSA. Suhu stabilitas: sampai 500 C pada pH 7 selama 1 jam aktivitas > 95 %. Aktivator: Ca2+, Na+, Mg2+, saliva. Inhibitor: Fe3+, Cu2+, Zn2+, Ag+- Struktur B7DEX berupa protein 1 subunit dengan estimasi BM 72,5 KDa. Hasil penelitian III menunjukkan bahwa B7DEX dapat menghidrolisis glukan dari plak gigi dengan aktivitas 7,38±0,66 U/ml, dimana aktivitas terhadap dekstran 31,88±1,24 U/ml. Dari penelitian IV diketahui bahwa berdasarkan mekanisme kerjanya maka B7DEX menghidrolisis dekstran dengan mekanisme kerja tipe-endo (endodekstranase). Terdapat 9 urutan DEX yang tergolong dalam famili B7DEX, meliputi: bebrapa dekstranase dari Arthrobacter sp, A. globiformis-T3044, Brevibacterium var dextranlyticum 0407, Penicillium minioluteum MUCL 38929, P. funiculosum, P. minioluteum dan isopullunase dari Aspergillus niger ATCC9642. Sepasang primer yang dirancang dari daerah lestari atas dasar asumsi homologi antara B7DEX dan dekstranase dari Arthrobacter globiformis (D88361) menghasilkan fragmen gen B7DEX 1013 pb pada proses amplifikasi dengan PCR di tahap penelitian Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa B7DEX dapat menghidrolisis plak gigi dan memiliki karakter-karakter yang menunjang kerjanya sebagai penghambat plak gigi. Oleh karena itu disarankan untuk melakukan fusi gen penyandi enzim B7DEX dan gen penyandi enzim mutanase, kemudian di-koekspresikan dalam flora rongga mulut, sehingga diperoleh sistem sinambung yang berfungsi sebagai anti plak gigi. Disarankan pula bagi upaya kloning gen penyandi protein atau enzim baru dengan homologi rendah, agar menggunakan pendekatan yang telah ditempuh dalam penelitian ini sehingga diperoleh fragmen gen B7DEX.

Actions (login required)

View Item