Noviyati, 050112449 (2005) OPTIMASI KONSENTRASI AMONIUM SULFAT PADA FRAKSINASI UNTUK ISOLASI PARSIAL PABA-GLUKOSILTRANSFERASE DARI KULTUR SUSPENSI SEL Solanum laciniatum Ait. Skripsi thesis, UNIVERSITAS AIRLANGGA.

Preview

Text (FULLTEXT) gdlhub-gdl-s1-2006-kkbkk2ff42-1589-ff42-06-u.pdf Download (2MB) | Preview

Abstract

Metabolit sekunder yang merupakan produk tanaman dapat diproduksi dengan kultur sel tanaman secara in vivo (Kurz & Constable, 1982). Selain dapat memproduksi metabolit sekunder, kultur jaringan tanaman juga dapat digunakan untuk sistem biotransformasi (Best, 1985). Reaksi biotransformasi dengan kultur jaringan tanaman yang telah diteliti antara lain reaksi biotransformasi glukosilasi asam para amino benzoat (PABA) oleh kultur suspensi sel Solanum mammosum dan Solanum laciniatum menjadi 0-D-glucose-1 -p-aminobenzoate (juga disebut p-aminobenzoic acid 7-0-f-D-glucopyranosyl ester) (Syahrani et al., 1999; Panjaitan et al., 2000), dikatalisis oleh enzim PABA-glukosiltransferase. Biotransformasi in vivo memiliki kendala diantaranya produk biotransformasi ini diakumulasi di dalam sel, sedikit sekali yang didapatkan pada media (Panjaitan et al., 2000). Sedangkan untuk isolasi produk hams dilakukan dengan mengekstraksi massa sel yang diperlukan untuk melakukan biotransformasi (Syahrani, 1996), dan keterbatasan kultur suspensi sel tanaman ataupun kultur fermentor tanaman yang tidak stabil selama dilakukan subkultur (Indrayanto & Rahman, 1990). Untuk mengatasi keterbatasan biotransformasi tersebut dilakukan isolasi enzim dengan salah satu tahapannya yang paling sering dilakukan adalah fraksinasi dengan amonium sulfat agar enzim yang terdapat dalam ekstrak kasar terpekatkan (Englard & Seifter, 1990). Penelitian-penelitian isolasi glukosiltransferase dengan fraksinasi amonium sulfat antara lain penelitian Li et al. (1997) yang mengisolasi 4–hydroxybenzoate glucosyltransferase menggunakan fraksi enzim 33–55%. Hasegawa et al. (1997) juga mengisolasi limonoid glukosiltransferase menggunakan fraksi enzim 40-80%, juga Mizukami et al. (1985) mengisolasi Salicyl alcohol glucosyltransferase diambil dari fraksi 0–80%. Rahmawati (2001) pada penelitian isolasi PABA-glukosiltransferase dari kultur suspensi sel Solanum mammosum L. dengan fraksinasi amonium sulfat mendapatkan enzim pembentuk produk yang menyerupai PABA-glukosida aktivitasnya terbesar pada fraksi enzim 40-50%. Untuk mengetahui pada konsentrasi amonitim sulfat ke berapa enzim PABA– glukosiltransferase diproduksi dari ekstrak kasar Solanum laciniatum dan memiliki aktivitas yang optimum maka perlu dilakukan optimasi. Kultur suspensi sel Solanum laciniatum ditanam dalam media Murashige-Skoog yang dimodifikasi dengan penambahan hormon pertumbuhan kinetin (2 ppm) dan 2,4D (0,5 ppm). Kultur suspensi sel Solanum laciniatum (SL4) dibuat dengan melakukan pemindahan ± 5 g sel dari media padat ke dalam media cair. Isolasi enzim PABA-glukosiltransferase pada kultur suspensi sel Solanum laciniatum yang dipanen pada usia kultur hari ke-5. Sel-sel kultur ± 50 g dibekukan dan digerus lalu ditambahkan PVPP 10% dari berat basah sel, digerus sampai homogen kemudian ditambah dapar Tris HC1 0,5 M pH 6 sebanyak 1,5 kali berat basah sel (± 75 mL), disentrifugasi dingin (4°C) 10.000 g, 30 menit. Supernatan sebagai ekstrak kasar enzim (crude enzyme) diambil. Fraksinasi Crude enzyme dengan penambahan sejumlah tertentu amonium sulfat menurut fraksi penjenuhan yang diinginkan. Hasil fraksinasi disentrifugasi dingin (4°C) 10.000 g, 30 menit. Endapan yang diperoleh dilarutkan dalam 1,5 mL dapar Tris HC1 0,5 M pH 5, untuk supernatannya dilakukan fraksinasi lebih lanjut. Fraksi enzim yang didapat dilakukan uji aktivitas relatif enzim dengan penambahan substrat PABA 7,3 mM 60 pL, substrat UDP-glukosa 7,3 mM 60 µL, dan dapar Tris HC1 0,5 M pH 5 sebanyak 200 µL kemudian diinkubasi selama 2 jam pada suhu kamar (29°C) di dalam incubation shaker dengan kecepatan 75 rpm sehingga terjadi reaksi enzimatik dan terbentuk produk. Reaksi ini ini dihentikan dengan aseton 360 pL. Kemudian disentrifugasi 3500 rpm 5 menit, diambil larutannya dan dilakukan uji aktivitas enzim dengan KLT. Pemisahan dengan KLT menggunakan fasa diam silika gel 60 F254, fasa gerak menggunakan campuran etil asetat : metanol : air = 77 : 13 : 10 (v/v). Penampak noda menggunakan sinar UV. Analisis densitometer dilakukan pada panjang gelombang 254 nm. Aktivitas enzim dihitung relatif terhadap PABA dengan membandingkan luas area produk dengan luas area PABA. Dari hasil penelitian yang telah dilakukan didapatkan kesimpulan : konsentrasi amonium sulfat yang optimal pada fraksinasi untuk isolasi PABA-glukosiltransferase dari kultur suspensi sel Solanum laciniatum adalah 20%. Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan didapatkan produk baru yang mempunyai Rf yang berbeda dengan PABA glikosida. Profil dan X maks dari produk juga berbeda dengan PABA-glikosida dilihat dari absorban-reflektan dari noda keduanya; disarankan produk perlu diidentifikasi untuk menentukan struktur kimianya. Fraksi enzim yang telah diperoleh perlu dilakukan pemurnian lebih lanjut misalnya dengan filtrasi gel atau dengan cara-cara kromatografi lainnya, dan pada kultur suspensi sel Solanum laciniatum perlu ditentukan indeks pertumbuhannya sehingga dapat dicari korelasi yang lebih tepat antara pertumbuhan sel dengan produksi enzim.

Actions (login required)

View Item