ANAK AGUNG ISTRI RATNADEWI, 090970210 (2013) KARAKTERISASI DAN IDENTIFIKASI DOMAIN KATALITIK DAN DOMAIN PENGIKAT SUBSTRAT ;-XILOSIDASE DARI Geobacillus thermoleovorans IT-08. Disertasi thesis, UNIVERSITAS AIRLANGGA.

Preview	Text (ABSTRAK) gdlhub-gdl-s3-2013-ratnadewia-26654-12.abst-t.pdf Download (236kB) | Preview
	Text (FULLTEXT) 32905.pdf Restricted to Registered users only Download (2MB) | Request a copy

Abstract

-D-xilosidase dari Geobacillus thermoleovorans IT-08 (GbtXyl43B) merupakan bagian klaster gen pengkode enzim xilanolitik dalam pTP510. GbtXyl43B dikelompokkan ke dalam famili GH43 yang sebelumnya diduga sebagai eksoxilanase. Urutan nukleotida dari gen pengoke GbtXyl43B telah disimpan dalam GenBank No. DQ387047. GbtXyl43B diindikasikan sebagai enzim yang memiliki keunikan didasarkan atas homologi yang sangat rendah terhadap enzim sejenisnya dalam famili GH43. Ini didukung oleh analisis BLASTN, BLASTX dan homologi dengan struktur enzim sejenisnya dalam keluarga GH43 yang menunjukkan homologi sebesar 19 #8722;37%. Berdasarkan data ini, penelitian lanjut karakterisasi GbtXyl43B dilakukan, yang meliputi penentuan profil produk hidrolisis xilan (larut dan tidak larut), arabinan, arabinoxilan, xiloglukan dan fruktan, serta substrat kromogen (pNPX, pNPXX, pNPA); penentuan residu asam amino yang berperan dalam sisi katalitik; perbandingan aktivitas antara GbtXyl43B varian dan GbtXyl43B asal (wild type); pembuatan model struktur tiga dimensi domain katalitik (CM) dan domain pengikat substrat (CBM) GbtXyl43B; dan analisi keunikan domain pengikat CBM GbtXyl43B dibanding dengan CBM yang lain. Gbtxyl43B yang disusun oleh 604 asam amino dengan prediksi massa molekul relatif ~74,5 kD dikode oleh xyl43B dengan panjang 1.815 bp. Dalam penelitian ini, xyl43B telah diamplifikasi dengan PCR, disubklon ke dalam pET30a, dan diekspresikan dalam Escherichia coli. Karakterisasi biokimia dan kinetika GbtXyl43B juga telah dilakukan. Analisis SDS-PAGE menunjukkan bahwa GbtXyl43B rekombinan murni menunjukkan massa molekul relatif ~72 kDa. Enzim ini mempunyai temperatur dan pH optimum pada 60 oC dan 6,0. GbtXyl43B stabil pada 60 oC selama 1 jam dan pH 6 #8722;8 pada 4 oC selama 24 jam. GbtXyl43B mempunyai KM sebesar 0,066±0,022 mM, Vmax sebesar 1,9×10–4±2,7×10–5 mM menit–1, kcat sebesar 3,2×10–4±1,76×10–5 s–1, dan kcat/KM sebesar 0,0048 ± 0,0010 s–1 mM–1. Analisis kromatografi lapis tipis menunjukkan GbtXyl43B menujukkan aktivitas eksoglikosidase pada substrat pNPX menghasilkan xilosa, namun tidak menunjukkan aktivitas pada substrat pNPXX. Aktivitas GbtXyl43B pada xilan oat yang tidak larut 8 kali lebih besar dibanding aktivitasnya pada xilan birchwood yang larut. Adsorbabilitas GbtXyl43B pada xilan oat sebesar 13% (w/w). Ini mengindikasikan GbtXyl43B memiliki CBM. Adsorbabilitas GbtXyl43B varian yang tidak memiliki aktivitas enzim juga masih menunjukkan kemampuan mengikat substrat yang kemampuannya hampir mirip dengan GbtXyl43B rekombinan. CBM GbtXyl43B (residu asam amino 15 #8722;149) mempunyai homologi maksimum 19% dengan CBM36 xilanase 43A dari Paenibacillus polymyxa (PDB No. 1UX7). Analisis bioinformatika menunjukkan GbtXyl43B diklasifikasikan ke dalam glikosil hidrolase famili GH43 yang mengandung CBM (residu asam amino 15–149 yang membentuk delapan untai antipararel) dan CM (residu asam amino 157–604 yang membentuk lima bilah baling-baling dengan residu katalitik pada Asp278 dan Glu476. CBM GbtXyl43B untuk pengikatan substrat yang didominasi oleh residu asam amino aromatik Phe merupakan subfamili CBM36 baru

Actions (login required)

View Item