Purkan, - (2003) Kloning Dan Over Ekspresi Gen Protein Disulfida Isomerase Ragi Saccharomyces cerevisiae DI Escherichia coli. Laporan Penelitian. MIPA - Kimia. (Unpublished)

Text (Laporan Penelitian) KKC 572 79 Pur K-.pdf Download (1MB)

Abstract

Protein disulfida isomerase (PDI, E.C.5.3.4.1) yang dikode oleh gen PDII ragi adalah suatu enzim yang berfungsi mengkatalisis reaksi pembentukan dan penataan ulang (isomerisasi) ikatan disulfida dalam proses folding polipeptida suatu protein ekstraselular atau protein jalur sekresi. Selain itu juga merupakan molekul chaperon yang membantu proses pelipatan protein di dalam retikulum endoplasma, dengan cara menghambat pembentukan ikatan disulfida selamafolding polipeptida sehingga pembentukannya tidak terjadi secara random. PDI mengarahkan pembentukan ikatan disulfida tersebut dapat terjadi diantara pasangan residu sistein yang tepat, sehingga menghasilkan molekul protein dengan struktur tersier yang native. PDI juga merupakan komponen dari dua enzim multimer prolil-4-hidroksilase dan protein kompleks pentransfer trigliserida mikrosom (Freedman et a1.,1994). Fungsi PDI sebagai enzim dan molekul chaperon, mendasari aplikasi PDI dalam bidang kedokteran, industri makanan, farmasi maupun industri kimia lainnya. Penggunaan PDI yang beragam menuntut penyediaannya dalam skala besar. Ragi Saccharomyces cerevisiae menghasilkan PDI kurang dari 0.05 % dari total protein sel (Mizunaga et a1.,1990). Rendahnya kadar PDI ragi ini memerlukan upaya over produksi PDI sehingga ketersediaanya dapat memenuhi kebutuhan di banyak industri. Penelitian ini dirancang untuk melakukan over produksi enzim protein disulfida isomerase (PDI) ragi Saccharomyces cerevisiae di Escherichia coli. Penelitian ini akan diawali dengan mengamplifikasi dan mengklon gen protein disulfida isomerase ragi (PDII)di Escherichia coli DH5oc. Permasalahan penelitian pada tahap awal ini adalah : apakah gen PDI ragi dapat diamplikasi dengan PCR, berapakah ukuran molekul gen PDI1, apakah penyambungan gen PDI1 ke vektor pGemT dapat menghasilkan rekombinan pGemT-PDII, dan apakah rekombinan tersebut dapat diklon di Escherichia coli DH5a. Penelitian tahap awal ini bertujuan untuk mengamplifikasi gen protein disulfida isomerase dengan PCR, menentukan ukuran gen hasil PCR, dan mendapatkan rekombinan pGem-T-PDII dalam klon Is. co/i D1-15a. Kloning gen Protein disulfida isomerase ragi di E. coli DH5a dikerjakan dengan cara mengamplifikasi gen PDI ragi menggunakan PCR. Amplikon hasil PCR selanjutnya diligasi dengan vektor kloning (plasmid pGem-T) untuk mendapatkan DNA rekombinan pGem-T-PDII. DNA rekombinan hasil konstruksi ini, kemudian digunakan untuk menstransformasi E. coli DH5a. Seleksi transforman dilakukan untuk mendapatkan klon E. coli DH5a [pGemT-PDII]. Amplifikasi gen PD11 ragi dengan dua buah primer, yaitu primer forward dan primer reverse menggunakan PCR telah berhasil mendapatkan suatu fragmen DNA berukuran ± 1700 pb. Sementara itu, ligasi amplikon hasil PCR dengan vektor T (pGem T) dapat menghasilkan rekombinan pGemT-PDII di dalam Escherichia coli DH5a. Karakterisasi pemotongan rekombinan pGemT-PDII dari beberapa transforman E.coli dengan enzim restriksi Ndel dan 13amHI menunjukkan bahwa gen PD11 telah berhasil terklon di E. coli DH5a. Kesimpulan dari penelitian ini adalah bahwa fragmen DNA berukuran ± 1700 pb yang ekuivalen dengan ukuran gen PD11 dapat dihasilkan dari amplifikasi gen PDIl ragi menggunakan PCR. Sebuah fragmen DNA (± 4700 pb) hasil pemotongan pGem T rekombinan oleh enzim tunggal Ndel, dan BamHI, serta dua fragmen DNA (± 3000 pb) dan (± 1700 pb) hasil pemotongan oleh dua enzim Ndel dan BamHI, menunjukkan bahwa rekombinan pGemT-PDII telah terkontruksi dan berhasil terklon di E. coli DH5a. Saran penelitian ini adalah perlunya melakukan penentuan urutan nukleotida gen PD11 yang telah diamplifikasi dan juga meng-over ekspresikan gen tersebut baik di E.coli maupun di ragi.

Actions (login required)

View Item